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如何设计CRISPR/CAS系统中的gRNA序列及需注意事项？
时间：2023-06-02 10:57:01 | 来源：网站运营
时间：2023-06-02 10:57:01 来源：网站运营
如何设计CRISPR/CAS系统中的gRNA序列及需注意事项？：
2021.12.26 利用CRISPR/CAS系统KO靶基因之gRNA设计流程细胞为你讲解：今天给大家分享如何利用CRISPR/CAS9系统敲除靶基因：对目标基因进行精确、高效、可控的遗传修饰，不光是解决人类面临重大遗传疾病、提高农业产能的潜在技术手段；同样是推动基础生物学研究的重要策略。对遗传信息进行改变包括了诱变技术、基因工程技术。以及后续基因编辑技术的出现，其大致包括锌指核酸酶技术(ZFN)、转录激活因子效应物核酸酶技术(TALEN）和CRISPR系统中RNA引导CAS蛋白效应核酸酶基因编辑技术。
CRISPR/CAS系统（clustered regularly interspaced palindromic repeats）是细菌进化而成的抵抗外源核酸的免疫系统。目前，发现的CRISPR/CAS根据不同的识别和切割的分子机制（主要包括单、多cas蛋白互作、靶向DNA或者RNA等），被分为了3大类。PAM（protospacer adjacent motif）序列是入侵核酸与crRNA靶向序列相邻的短序列。
CRISPR/Cas9是第二类中依赖gRNA引导单一具有内切核酸酶活心的cas9蛋白形成复合物（sgRNA的3’端是具有结合cas9蛋白的双链RNA结构，负责招募cas9到靶向区域），实现对核酸DNA效应，依赖细胞中自身的同源重组（HDR）或者非同源末端连接（NHEJ）的途径，实现目标基因序列改变。其简单、高效、精确，被广泛地应用到了生命科学研究。2020年诺贝尔化学奖颁给了法国和美国科学家Emmanuelle Charpentier、Jennifer A. Doudna，以表彰她们“开发出一种基因组编辑方法”。无疑是CRISPR/Cas9基因编辑技术重要性的体现。
那么如何在日常科研中，利用CAS9系统KO靶基因呢？如何设计有效的gRNA序列呢？现在给大家介绍gRNA设计流程（文献报道过的有效gRNA可以使用；没有的话，可以按照下面流程设计）：这里就针对应用CRISPR/Cas9基因编辑人源细胞的P53基因， 利用张峰实验网站（
http://crispr.mit.edu/）设计关于P53的sgRNA序列常规步骤：
- 先在NCBI网站上查询并下载TP53基因组序列。
1、——
>查询目标基因（加上限定物种） 2、—
—>目标基因基本信息。
—
—>P53基因基因组序列下载，复制目标编辑位点序列信息。- 在浏览器中输入并查询网站：http://crispr.mit.edu/。
1、
在TOOLS FOR GUIDE DESSIGN项中找并点击CRISPOR。2
、出现如下页面—>gRNA 设计页面，按照提示进行Step步骤设计。3、根据前面下载P53基因组上序列信息，复制需要进行RNA编辑的目标区域序列，并粘贴到Step1中，在step2中选择物种信息，在step3中选择实验室常用到cas9蛋白和PAM序列NGG要的选项，然后点击SUBMIT。举例A、选取TP53基因前100bp左右粘贴到在step1中（Squence name空栏可不填写）。
- 根据网站设计不同的gRNG，选取合适和评分最高的gRNA即可出。
5、最后在设计好的gRNA序列的5’端点引入酶切位点，合成单链的正反向序列，酶切链接到建好表达载体上（载体有相同酶切位点）。
sgRNA构建注意：- 设计的sgRNA序列5’端20bp序列信息决定了编辑位点，其序列与编辑位点的核苷酸序列互补配对，但前提是靶向区域存在PAM序列，所以设计sgRNA后面带有PAM序列（NGG），当sgRNA与靶向片段配对后，cas9蛋白就会在PAM序列前3个核苷酸位置对DNA双链进行切割，形成双链断裂（DSBs），随着后面的DNA修复过随机产生突变，利用突变产生而形成编辑。
祝大家科研顺利，每天都有datas！（如果对你有帮助，记得关注和点赞哦！！后续继续为大家分享）
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